1. mục đích:
Nhằm phát hiện hoặc định lượng vi sinh vật thông qua lượng vật chất di truyền (acid
nucleic, DNA/RNA) được tìm thấy trong huyết hanh bệnh nhân hay các loại bệnh phẩm
khác...
Hiện nay chủ
yếu được sử dụng để phát hiện HBV, HCV, HIV, HPV, EBV, HSV, CMV, Dengue...
2. ứng dụng
- định danh
(định type), định lượng nồng độ virus, vi sinh vật
- tiên lượng,
theo dõi kết quả điều trị một số bệnh lý (định lượng nồng độ HBV, HCV, HIV)
- xác định
đột biến gen kháng thuốc (HBV, HIV)
3. ưu điểm
- phát hiện
được hầu hết các loại vi sinh vật ở mức độ gen
- độ nhạy
và độ đặc hiệu cao
- có thể
phát hiện ngay khi cơ thể chưa sinh đáp ứng miễn dịch ở người bệnh
4. hạn chế
- kết quả dễ
sai lệch nếu bị tạp nhiễm
- đòi hỏi
trang thiết bị và thao tác kỹ thuật hết sức cẩn thận
- giá thành
xét nghiệm cao
5. phương pháp
+ phương pháp khuếch đại tín hiệu:
Bộ gen của
virus được lai với các đoạn probe gắn tín hiệu (oligonucleotid bắt giữ đặc hiệu),
sau đó tín hiệu phát ra được khuếch đại và đo lường.
- lai thể lỏng/dịch
thể (liquid hybridization)
- lai
DNA-RNA (DNA-RNA hybridization)
- kỹ thuật
DNA nhánh (Branched DNA technology/ bDNA)
+ phương pháp khuếch đại gen đích:
Đoạn gen
đích đặc trưng của virus được khuếch đại sử dụng mồi đặc hiệu, sau đó sản phẩm
khuếch đại được phát hiện nhờ tín hiệu huỳnh quang hoặc kết quả điện di
- PCR
(polymerase chain reaction/ phản ứng trùng hợp chuỗi): real-time PCR, RT-PCR
- TMA
(transcription - mediated amplification / khuếch đại trung gian phiên mã)
- NASBA
(nucleic acid sequencing based amplification / khuếch đại dựa tên trình tự acid
nucleic)
- LCR
(ligase chain reaction / phản ứng chuỗi lai)
* PCR (Polymerase chain reaction)
Phản ứng trùng hợp chuỗi gene
Được phát minh năm 1983 bởi Dr Karry Mullis và ông giành giải Nobel hóa học với công trình này vào năm 1993
PCR là
quá trình tổng hợp DNA gene đích trong ống
nghiệm. Số lượng DNA tăng lên sau mỗi chu kỳ theo hàm số mũ
Polymerase là tên enzyme được sử dụng trong phản ứng này.
Gọi
là chuỗi vì sản phẩm
DNA được tạo ra ban đầu sẽ đóng vai trò khuôn
mẫu cho phản ứng tiếp theo.
Các thành phần phản ứng
PCR
1) DNA đích - Mẫu chứa đoạn DNA cần nhân lên
2) Cặp mồi đặc hiệu: là 2 trình tự nucleotide ngắn đặc trưng cho gen cần nhân lên F- mồi xuôi,
R- mồi ngược
4) dNTPs là
các nucleotide tự do dùng làm nguyên liệu cho quá trình tổng hợp
3) DNA Polymerase bền nhiệt
5) Mg++ ions – đóng
vai trò xúc tác hoạt hóa enzyme
6) Dung dịch đệm – duy trì pH và nồng độ điện giải phù hợp cho phản ứng
Các chu kỳ nhiệt cơ bản
của PCR
30 - 35
chu kỳ nhiệt, mỗi chu kỳ bao gồm:
– Biến tính DNA (94°C - 96°C), 30 giây.
– Gắn mồi (55–60°C), 30 giây.
– Kéo dài (72°C), thời gian phụ thuộc vào kích thước sản phẩm DNA.
Máy luân nhiệt PCR
Taq polymerase
Thermus aquaticus, Vi khuẩn sống ở suối nước nóng được
phát hiện năm 1969 ở vườn quốc gia Yellowstone, US. Vi khuẩn này chịu được nhiệt độ cao nên DNA polymerase (Taq) của vi khuẩn
này được phân lập.
Một số loại
Polymerases bền nhiệt
Số DNA coppy =
2^n
Số coppy đoạn DNA mong
muốn < 2^n
Điện di DNA trên thạch agarose:
Đọc sản phẩm sau PCR
trên bản gel thạch
* kỹ thuật real-time PCR:
nguyên lý:
Kỹ thuật
real-time PCR là kỹ thuật PCR mà kết quả khuếch đại DNA đích hiển thị được ngay
sai mỗi chu kỳ nhiệt của phản ứng.
Các sản phẩm
của quá trình chạy PCR được gắn với huỳnh quang và dựa vào ngưỡng phát hiện huỳnh
quang (sớm hay muộn) mà người làm thí nghiệm sẽ biết được số lượng DNA đích ban
đầu có trong ống phản ứng.
- trục
tung: biểu diễn cường độ huỳnh quang phát ra từ ống phản ứng khi nhận ánh sáng
kích thích
- trục
hoành: biểu diễn số chu kỳ nhiệt
- đường nền
(baseline): là số chu kỳ PCR trong đó tín hiệu huỳnh quang đặc hiệu tích lũy dần
nhưng chưa đạt ngưỡng nhận biết của thiết bị. Theo mặc định, đường nền được xác
lập trong khoảng chu kỳ 3 đến 15 và có thể được thay đổi.
- cường độ
huỳnh quang nền: trung bình cộng của cường độ huỳnh quang xuất hiện trong ống
phản ứng trong 1 số chu kỳ đầu
- chu kỳ
ngưỡng (Ct): là chu kỳ nhiệt mà ở tại thời điểm đó, thiết bị realtime ghi nhận
được tín hiệu huỳnh quang phát ra từ ống phản ứng bắt đầu vượt quá cường độ huỳnh
quang nền
- Ct của một ống phản ứng (sớm hay muộn) phụ thuộc vào số lượng DNA đích
ban đầu có trong ống phản ứng.
Để
real-time PCR xác định được chính xác số lượng bản đích ban đầu có trong mẫu thử,
phải thực hiện real-time PCR các mẫu thử
chứa các số lượng bản DNA đích ban đầu cần xác định số lượng cùng lúc với các mẫu chuẩn chứa số lượng
DNA đích ban đầu đã biết rõ số lượng.
Thành phần của phản ứng real-time PCR:
- DNA (mẫu
bệnh nhân, chứng âm, chứng dương, standard)
- DNA
polymerase
- mồi đặc
hiệu
- dNTPs
- dung dịch
đệm
- chất phát huỳnh quang:
. chất màu huỳnh quang chèn vào sợi đôi DNA: SYBR Green
Đặc điểm là
có ái lực rất cao với sợi đôi DNA và chúng có khả năng làm cho sợi đôi DNA phát
huỳnh quang khi nhận được nguồn sáng kích thước.
Trong quá
trình khuếch đại thì chất màu huỳnh quang sẽ chèn vào sợi đôi DNA giai đoạn kéo
dài và hệ thống nhận biết của máy sẽ ghi nhận tín hiệu huỳnh quang ở thời điểm
kết thúc của mỗi chu kỳ nhiệt.
. probe (các đoạn trình tự dò): Taqman probe, Beacon probe...
Probe là những
đoạn trình tự oligonucleotid sợi đơn có khả năng bắt cặp đặc hiệu với DNA đích
và hiện tượng bắt cặp này sẽ dẫn đến sự phát huỳnh quang.
Cường độ huỳnh
quang phụ thuộc vào số lượng probe bắt cặp, hay chính xác hơn là phụ thuộc vào
số lượng bản sao DNA đặc hiệu hiện diện trong ống phản ứng.
1. SYBR Green
Cơ chế hoạt động của
SYBR I
(1) Khi chưa có sản phẩm khuếch đại thì ống thứ
nghiệm không phát được hùynh quang khi nhận được ánh sáng kích thích
(2) Nhưng khi có hiện diện của sản phẩm khuếch
đại thì SYBR I chèn vào và tập trung trên phân tử DNA , làm cho ống phản ứng bị
phát huỳnh quang khi nhân được ánh sáng kích thích
2. Taqman Probe
[1] Khi chưa có mặt sản phẩm khuếch đại đặc hiệu,
Taqman probe không phát được huỳnh quang khi nhận được nguồn sáng kích thích vì
huỳnh quang phát ra bị quencher hấp phụ hết
[2a] Khi có mặt sản phẩm khuếch đại đặc hiệu, Taqman
probe sẽ bắt cặp trên trình tự đặc hiệu của sản phẩm khuếch đại ở giai đoạn nhiệt
độ bắt cặp sau giai đoạn biến tính
[2b] Taqman probe sẽ trở thành trình tự cản đầu
3’ khi Taq polymerase kéo dài mồi để bắt đầu tổng hợp sợi bổ sung
[2c] Nhờ có hoạt tính 5’-3’ exonuclease nên Taq
polymerase sẽ cắt bỏ Taqman probe làm reporter bị cắt rời xa quencher và nhờ vậy
mà huỳnh quang phát ra từ reporter sẽ không còn bị quencer hấp phụ nữa
[2d] Giai đoạn phát huỳnh quang của reporter xảy
ra trong suốt quá trình Taq polymerase kéo dài mồi để tổng hợp sợi bổ sung
3. Beacon Probe
Khi không có mặt sản phẩm khuếch đại đặc hiệu, ở giai đọan nhiệt độ bắt
cặp, Beacon probe sẽ không phát được huỳnh quang khi nhận được nguồn sáng kích
thích vì cấu trúc chân tóc của hai đầu đã làm cho repoter gần với quencher khiến
tất cả huỳnh quang phát từ reporter đều bị quencher hấp phụ
Khi có mặt sản phẩm khuếch đại đặc hiệu, ở giai đoạn nhiệt độ bắt cặp,
Beacon probe bắt cặp vào trình tự đặc hiệu trên sợi đích của sản phẩm khuếch đại,
nhờ vậy reporter cách xa quencher nên reporter phát được huỳnh quang khi nhận
nguồn sáng kích thích
Trong giai đọan nhiệt độ kéo dài, Taq
polymerase được sử dụng không thủy giải Beacon probe mà chỉ làm tách Beacon probe
khỏi sợi đích khi sợi bổ sung được tổng hợp kéo dài đến trình tự mà probe bắt cặp
vào.
Cuối giai đọan kéo dài, Beacon probe tách khỏi
sợi đích và trở lại cấu trúch chân tóc nên không cho reporter không được hùynh quang
nếu nhận được nguồn sáng kích thích
Trả kết quả real-time PCR:
Ưu - nhược điểm của PCR điện di:
Ưu điểm:
- hóa chất
rẻ tiền
- thiết bị
đơn giản - rẻ tiền
- phân tích
kết quả rõ ràng
- khả năng
multiplex
Nhược điểm:
- nguy cơ
ngoại nhiễm cao => tổ chức lab hợp lý, sử dụng uracil-N-Glycosylase, thực hành tốt PCR
- độ nhạy
thấp hơn real-time PCR
- độ đặc hiệu
thấp hơn real-time PCR
- không định
lượng được số bản mẫu ban đầu
- không cho
phép tự động hóa
- độc hại
- mất nhiều
thời gian
- nhiều biến
động
Nested PCR
Có thể xảy
ra lỗi khi nhân đoạn DNA bằng PCR do:
- một
số nhất định phân tử DNA có đột biến điểm
nucleotide
=>
Sử dụng enzyme có khả năng đọc kiểm tra trình
tự sau khi tổng hợp xong
PCR không
thể sử dụng trực tiếp RNA vì DNA polymerase cần khuôn mẫu là DNA. Do đó mRNA cần phải chuyển sang dạng cDNA bằng cách dùng enzyme sao chép ngược. Lúc này cDNA đóng vai trò
khuôn mẫu cho phản ứng PCR, không
cần sợi đôi.
=> kỹ
thuật RT-PCR
RT-PCR (reverse transcriptase polymerase chain
reaction) là phương pháp dùng để khuếch đại cDNA được tạo ra từ RNA dựa vào đặc
tính phiên mã ngược.
Trong kỹ
thuật RT-PCR có sự tham gia của 2 loại enzyme:
- Reverse
transcriptase
- DNA
polymerase
Kỹ thuật
RT-PCR gồm 2 bước:
Bước 1. tổng hợp cDNA:
. ủ mẫu với
enzyme phiên mã ngược (reverse transcriptase) để tổng hợp sợi đơn DNA
. phá hủy
liên kết hydro giữa DNA - RNA bằng dung dịch kiềm. cấu trúc dạng kẹp tóc được
hình thành.
. ủ với DNA
polymerase để tổng hợp mạch còn lại
. sử dụng
S1 nuclease để cắt cấu trúc kẹp tóc
Bước 2. khuếch đại gen (PCR/real-time PCR)
Các loại PCR
- PCR
thường: nhân bản DNA và phát hiện số bản sao DNA được thực hiện riêng rẽ
- Real-time
PCR: bước nhân bản và phát hiện PCR được
xảy ra đồng thời
- PCR
định lượng: xác định số lượng DNA hoặc RNA
có trong bệnh phẩm
- Multiplex
PCR: phát hiện đồng thời nhiều gene của
các virus khác nhau trong một hỗn hợp phản
ứng
Ứng dụng của PCR
Molecular Identification
. DNA fingerprinting
. Classification of organisms
. Genotyping
. Pre-natal diagnosis
. Mutation screening
. Drug discovery
. Genetic matching
. Detection of pathogens
Sequencing Genetic
. Bioinformatics
. Genomic cloning
. Human Genome Project
Engineering
. Site-directed mutagenesis
. Gene expression studies
Giải trình tự gene
- Phương
pháp giải trình tự gen truyền thống
- Phương
pháp giải trình tự gen Sanger
Ưu nhược điểm của kỹ
thuật SHPT
. Ưu điểm: độ nhạy độ đặc hiệu cao, thời gian trả kết quả nhanh
. Nhược điểm: giá thành cao, đòi hỏi những yêu cầu phức tạp khi bố trí phòng thí nghiệm
và quản lý chất lượng xét nghiệm
